Jak to bywa prawie ze wszystkimi papieżami pierwszych wieków chrześcijaństwa, niewiele wiemy o młodości Mikołaja. Urodził się prawdopodobnie ok. 820 r. w Rzymie i pochodził ze znakomitej rodziny urzędnika miejskiego Teodora. Można też spotkać informację, że pochodził ze starożytnego rzymskiego rodu Contich i był krewnym papieża Leona IV. W dokumentach pojawia się dopiero jako duchowny Kościoła w Rzymie. Papież Sergiusz II wyświęcił go na subdiakona, a św. Leon IV na diakona. Szczególne zaufanie okazywał Mikołajowi papież Benedykt III, wysyłając go w różnych misjach i poselstwach. Po jego śmierci Mikołaj został wybrany papieżem i w obecności cesarza Ludwika II otrzymał święcenia kapłańskie oraz sakrę biskupią. Następnego dnia, 25 kwietnia 858 r., odbyła się w bazylice św. Piotra jego uroczysta koronacja, bodajże pierwsza w dziejach papiestwa. Od tego pontyfikatu przez ponad 1000 lat (bo aż do 1965 r., kiedy Paweł VI z niej zrezygnował) potrójna korona - tiara była symbolem papiestwa. Trzy diademy oznaczały papieską władzę niebiańską, ziemską i nad czyśćcem. W dwa dni po koronacji Mikołaj złożył wizytę oficjalną cesarzowi w jego pałacu rzymskim. Cesarz dla okazania papieżowi szczególnej czci wyszedł mu naprzeciw i prowadził mu konia, co było wydarzeniem bez precedensu.
Pierwszym aktem nowego papieża było połączenie unią personalną biskupstwa Bremy z metropolitą Hamburga. Ponowił także nadany św. Oskarowi i jego następcom na stolicy hamburskiej przywilej legata papieskiego na obszar Danii, Szwecji i Pomorza. Na rok przed wyborem papieża Mikołaja I, na cesarza wschodniego wpłynął Focjusz, naciskając, by cesarz deponował z urzędu patriarchę Konstantynopola św. Ignacego. Jego miejsce zajął właśnie Focjusz. Na wiadomość, że papieżem został wybrany Mikołaj, patriarcha Konstantynopola Focjusz wysłał do niego delegację z doniesieniem, jakoby św. Ignacy dobrowolnie zrezygnował. Papież wolał jednak sprawę zbadać dokładnie. Kiedy przekonał się, że Focjusz objął patriarchat nielegalnie, obarczył go karami kościelnymi. Stało się to bezpośrednią przyczyną do zerwania z Rzymem. Focjusz posunął się do tego, że zwołał synod, na którym rzucił klątwę na papieża.
Konflikt z Konstantynopolem zaostrzyła jeszcze tzw. "sprawa bułgarska". Św. Borys, król Bułgarów, który przyjął chrzest z Konstantynopola, by uniezależnić się od cesarstwa, zwrócił się do papieża z prośbą o misjonarzy oraz o wyjaśnienie pewnych kwestii. W odpowiedzi na to papież wysłał w roku 867 głośne Odpowiedzi na pytania Bułgarów, w których złagodził wiele zbyt twardych ustaw Kościoła bizantyńskiego.
Nie mniej stanowczy okazał się papież w sporze z królem Lotarem II, bratem cesarza niemieckiego, od którego imienia przyjęła się nazwa obecnej Lotaryngii. Władca ten był zaślubiony z księżniczką burgundzką, Teutbergą, ale zakochał się w konkubinie, Waldradzie. Dla pozbycia się prawej małżonki oskarżył ją przed papieżem o zdradę. Odbyty sąd wykazał jednak niewinność Teutbergi. Rozgniewany król zażądał ponownego sądu formalnego. Nieszczęsna małżonka, wymęczona torturami, przyznała się do niepopełnionej winy. Metropolici Kolonii i Trewiru stanęli po stronie króla. Również synody w roku 860 i 862 uznały małżeństwo króla z Teutbergą za nieważne. Papież wysłał więc swoich delegatów dla zbadania sprawy. Lotar jednak zdołał ich przekupić i zastraszyć. Na wiadomość o tym papież zdegradował zarówno legatów, jak i wspomnianych wcześniej metropolitów. Pierwsze małżeństwo uznał za ważne, a Waldradzie wyznaczył kanoniczną pokutę. Teutberga powróciła na zamek. Kiedy jednak Lotar ponownie rozpoczął współżycie z Waldradą, papież rzucił na króla klątwę.
Kiedy metropolita Reims, Hinkmar, bez kanonicznego powodu złożył z urzędu biskupa Soissons, ten odwołał się do papieża. Papież unieważnił wyrok metropolity. Mikołaj usunął z urzędu metropolitę Rawenny, kiedy ten samowolnie zaczął łamać rozporządzenia papieskie. Kiedy jednak uznał swoją winę, papież zdjął z niego kary kościelne. Polecił jednak przy tym, żeby metropolita postępował roztropniej ze swoimi sufraganami oraz by duchowieństwa nie obciążał zbytnio świadczeniami fiskalnymi. Za pontyfikatu Mikołaja I święci Cyryl i Metody w 863 r. dokonali chrystianizacji Moraw.
Mikołaj był mężem modlitwy. Okazywał szczególną wrażliwość na sprawy Boże i na niedolę bliźnich. Sprawiedliwość była jego naczelnym hasłem. Okazał się także doskonałym administratorem. Dla męstwa i odwagi, z jaką piętnował grzechy możnych, nazwano go "drugim Eliaszem". Był zdania, że papież posiada władzę bezpośrednio od Pana Boga i że jest odpowiedzialny za cały rodzaj ludzki, dlatego nie ma większej władzy niż papieska. Za rządów Mikołaja I w Europie panowali władcy reprezentujący o wiele skromniejszy od niego wymiar osobowy. Dlatego papież miał najwyższy autorytet, a przy tym uważał się zawsze za sługę Boga, który odpowiadać będzie za powierzone sobie przewodzenie Kościołowi Chrystusa.
Mikołaj I zmarł w Rzymie 13 listopada 867 r. i został pochowany w bazylice św. Piotra. Opłakiwały go rzesze wiernych, a zwłaszcza ubodzy. Pamiętali jego dobroć, bo papież w kazaniach wzywał możnych do hojnej jałmużny, aby nikt w Rzymie nie musiał cierpieć głodu.
Chociaż jego pontyfikat trwał tylko 9 lat, to trwale zmienił papiestwo i wyznaczył wzorce dla papieży następnych wieków. Mikołaj jako pierwszy sformułował pogląd, że papież jest zastępcą Chrystusa na ziemi oraz że sprawując władzę i opiekę nad całym Kościołem, jest wolny i niezależny od władzy świeckiej. Przekonał współczesnych, że papieskie dyspozycje obowiązują zarówno świeckich, jak i duchownych. Są one ostateczne i niezmienne, a synody należy traktować tylko jako organy wykonawcze papieskich poleceń. Potomni nadali mu tytuł Wielkiego.